Nature子刊：新技术预测CRISPR-Cas9潜在风险，捕获AAV瞬时、低水平转基因表达 | 医麦猛爆料
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2019年8月4日/医麦客 eMedClub/--2019年7月30日，费城儿童医院（CHOP）的研究人员在Nature Communications杂志上发表了一篇名为Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing研究论文，该研究团队开发了一种更灵敏的捕获AAV载体足迹的方法（即AAV载体转移遗传物质的位点），其能捕获到AAV载体瞬时、低水平的转基因表达。
通过该方法揭示了许多以前未知的AAV表达位点，并突出了在AAV递送后可能在其他器官和细胞类型进行基因编辑的位点，该方法拓展研究人员对已知向性组织内AAV表达的范围，较之传统筛查AAV方法，其显示出显著的优越性，其从根本上重新定义了AAV介导的基因转移的真实程度，通过捕获由AAV载体引起的全部基因表达，该技术有望显著推进基因治疗领域的快速发展。
AAV（腺相关病毒）载体是生物工程工具，运用改良无害的病毒将需要的遗传物质安全地运输到不健康组织和细胞当中，载体将“基因货物”传递到组织中后，修饰的基因将为这些组织提供新指令并帮助治疗疾病。
可以说病毒载体几乎与基因疗法相伴而生的，早先CHOP率先推出的载体技术就促成了FDA批准的首批基因疗法的开发，如用于B细胞急性淋巴细胞白血病的Kymriah和用于遗传性视网膜疾病的Luxturna基因疗法，但为了安全有效地应用病毒载体，全面了解其在体内传递遗传物质的位置至关重要。
目前鉴定腺相关病毒（AAV）载体在体内转导遗传物质情况的的常规方法基于目标基因高水平、稳定表达，进而以突出摄取和表达传递的遗传物质的细胞，然而，这种方法必然忽略了瞬时转导的细胞类型或具有低至不可检测到的目标基因表达水平，这种现象为基于AAV的基因组编辑技术创造了盲点，因此，更好地检测AAV载体DNA的完整转录情况方法对于AAV的基因组编辑应用是必不可少的。
CRISPR-Cas9系统的发现彻底改变了生物医学研究中的基因组编辑，并为新的精准医学开启了大门，CRISPR / Cas9可以实现在短时间内或低水平表达的靶向DNA编辑,由于AAV具有明确的体内安全性，其已被广泛应用于CRISPR / Cas9系统的递送，但其也未能捕捉到低水平、或与编辑相关的瞬时转基因表达，然而， 对于像CRISPR / Cas9这样的基因组编辑工具，只需其少量表达就可以永久改变宿主DNA，如果其在非预期的组织中表达，即使是AAV载体的低表达也可能存在风险。
因此，基于被遗漏许多低水平基因转移位点所带来的风险，AAV与基因编辑的结合更需要一种更灵敏的方法来实现安全有效的应用。
为了解决以上提出的问题，该研究团队提出了一种捕获瞬时、低AAV转基因表达的方法，展示了许多以前未知的AAV靶向位点，可以使研究人员更好地检测遗传物质的表达位置，即使它表达的极低水平或只是很短的时间的情况下，与传统筛查方法的并排比较中，也更好地预测了AAV-CRISPR递送后的基因编辑足迹，该系统将捕获体内AAV载体的全部转导模式，成为当前和新兴AAV技术的基础。
在小鼠肝脏AAV8高效转导转基因表达的检测中，注射后AAV824小时内，发现几乎所有肝细胞都内化全身给药的AAV载体，其研究结果显示，在常用的AAV8载体剂量下，几乎所有肝细胞都以足以进行基因编辑的水平表达载体DNA，然而重要的是，只有瞬时转基因表达标记的肝细胞亚群最终表现出稳定的表达。
此外，该在AAV8载体研究中，还对非AAV8嗜性组织进行了分析，如肝脏，肾脏和脾脏中，正如所料，Ai14小鼠小鼠在已知AAV8嗜性组织（心脏和肝脏）的组织中显示表达，然而，尽管AAV8在肝脏转基因表达较高，但仍然存在肾小球转导，尽管水平低于先前水平，还值得注意的是，在脾中也存在相当大的转基因表达。
▲捕获AAV8在Ai14小鼠内跨组织的转基因表达( 图片来源：Nature Communications)
基于上述情况，该研究团队运用SpCas9测来检测CRISPR / Cas编辑系统的灵敏度，结果发现在脑，心脏，肺，肝，肾，脾，骨骼肌和睾丸中检测到广泛的CRISPR-Cas9编辑，此外，还在Ai14xSpCas9小鼠的十二指肠，胰腺和淋巴结中ye 检测到CRISPR-Cas9编辑。
▲ 捕获AAV8-CRISPR-Cas9在Ai14x Spcas9小鼠跨组织编辑( 图片来源：Nature Communications)
这些结果表明，传统方法低估了AAV介导的转基因表达范围，其提供一种更好地揭示了AAV介导的基因转移的真实程度的方法，这对于AAV的基因组编辑应用和AAV载体生物学的未来研究至关重要，这项研究表明，AAV载体导致基因转移在比我们最初意识到的更多。
这种新型的筛选方法将有助于提高基于AAV的基因编辑技术的安全性，它更好地定义了载体表达修饰基因的位点，重要的是，该研究表明，有效编辑并不依赖高水平且稳定的表达，对于更稳定的表达而言，不理想的剂量水平也可能对基因组编辑非常有效。
另外，这种方法将大大扩展AAV平台的实用性，通过揭示新的、前所未有的基因转移位点，它使研究人员更好地理解AAV载体基本生物学特性以及知道其提供基因有效载荷所需的条件。
参考出处
https://medicalxpress.com/news/2019-07-redefine-footprint-viral-vector-gene.html
https://www.nature.com/articles/s41467-019-11321-7
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